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流式樣品制備過程

2015-03-12 瀏覽次數：3191

流式細胞以檢測分析的對象是細胞或者細胞樣顆粒性物質，所以流式細胞術是細胞學的重要研究手段之一下面我們介紹一下用于流式細胞儀分析的單細胞懸液。

獨立細胞樣品的制備

如果是是懸浮細胞則直接收集細胞于離心管，離心沉淀細胞，用PBS重懸洗一次，然后固定待測，或取適量細胞與EP管中，標記相應的熒光偶聯抗體，zui后吸取未結合的抗體，然后固定待測。
如果細胞是貼壁細胞，需要胰酶消化細胞適當時間后，用移液器反復吹打，收集待測樣品細胞，離心后固定，或標記抗體。
- 將培養細胞用0.25%的胰蛋白酶消化，至顯微鏡下見到貼壁細胞回縮變圓為止，棄掉消化液，加入PBS用吸管將細胞從瓶壁上輕輕吹打下來，并移入離心管中。
- 短時低速離心，即1000r/min離心5min
- 棄上清，加pH 7.4的PBS液洗2次，1000r/min離心5min，以去除細胞懸液中的細胞碎片
- 加入固定液固定或低溫保存待用。
如果研究對象是外周血，根據目標細胞的不同可以有兩種處理方法。如果研究對象是外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）,zui常用的提取方法是Ficoll-hypague密度梯度離心法。

Ficoll-hypague密度梯度離心法分離PBMC：

抽取適量的血液于離心管中，該離心管必須事先加上抗凝劑，防止血液凝固。
用PBS稀釋血液，稀釋倍數可以根據血液的稠度加以調整，一般以2-4倍為宜。
根據血液的總量選用15ml離心管或者50ml離心管，先加入離心管1/4體積的Ficoll分離液，然后慢慢將稀釋后的血液小心疊加到Ficoll分離液的上層，體積是Ficoll液體積的2.5-3倍為宜。注意疊加血液時一定要輕柔，避免加入的血液與Ficoll液相混合，這一步很關鍵，如果血液層與Ficoll液層互相混合，就無法成功分離PBMC
將離心管在水平離心機中離心，2000r/min離心30min。
取出離心管，此時離心管內的液體分為三層，上層為血漿，中層為含PBMC的Ficoll液，zui下層為紅細胞，注意此時要輕拿輕放，切勿將分層的液體重新混勻。PBMC主要位于Ficoll液的上層，即血漿與Ficoll液層的交界處，肉眼見到的混濁絮狀物就是PBMC，用吸管小心吸取中層的Ficoll液，盡量吸盡其中的混濁絮狀物，吸入少量血漿不會影響結果，但需避免吸入zui下層的紅細胞。